Referenčni geni v PCR v realnem času

Referenčni geni so geni, ki kodirajo beljakovine ali RNA, vključene v osnovne celične procese, kot so vzdrževanje celične strukture, presnova, sinteza beljakovin in pridobivanje energije. Ker so ti procesi nujni za normalno delovanje in preživetje skoraj vseh celic, se referenčni geni običajno izražajo na razmeroma stalni ravni ne glede na celični tip ali eksperimentalne pogoje. Prav zaradi te lastnosti jih uporabljamo kot notranjo kontrolo pri analizi izražanja genov z metodo RT-qPCR. Njihova naloga je omogočiti normalizacijo rezultatov, saj zmanjšajo vpliv razlik v količini začetnega RNA, učinkovitosti pretvorbe RNA v cDNA ter tehničnih odstopanj med posameznimi vzorci. S primerjavo izražanja tarčnega gena z izražanjem stabilnega referenčnega gena lahko natančneje ocenimo dejanske biološke spremembe v izražanju genov.

V preteklosti so se kot referenčni geni pogosto uporabljali t. i. housekeeping geni, saj so veljali za enakomerno izražene v vseh celicah. Vendar so raziskave pokazale, da se lahko tudi njihovo izražanje spreminja glede na vrsto tkiva, razvojno stopnjo, bolezensko stanje ali eksperimentalne pogoje. Zato je danes pred vsako analizo nujno preveriti stabilnost izražanja kandidatnih referenčnih genov in izbrati tiste, ki so v izbranem eksperimentalnem sistemu najbolj stabilni. Le ustrezno izbrani referenčni geni zagotavljajo zanesljivo normalizacijo in pravilno interpretacijo rezultatov analize izražanja genov.

Ena najpogosteje uporabljenih metod za kvantifikacijo izražanja genov je verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR), ki omogoča sprotno spremljanje nastajanja produkta PCR. Pri tej metodi se pogosto uporabljajo fluorescenčne sonde, ki povečajo specifičnost in omogočajo natančno kvantifikacijo količine specifične DNA v vzorcu. Za uspešno izvedbo postopka je nujno pridobiti čisto in kakovostno DNA oziroma cDNA, nato pa rezultate pravilno analizirati z upoštevanjem notranjih kontrol – referenčnih genov.

Kljub pogosti uporabi nekaterih standardnih referenčnih genov, kot so GAPDH, ACTB ali 18S rRNA, ne obstaja univerzalni referenčni gen, ki bi bil enako stabilen v vseh vrstah tkiv, celičnih linijah ali eksperimentalnih pogojih. Izražanje genov se namreč med tkivi in pogoji bistveno razlikuje, zato je potrebno za vsak biološki sistem posebej ugotoviti, kateri referenčni gen je najprimernejši. To vključuje preverjanje stabilnosti več kandidatnih genov, njihovo medsebojno primerjavo in normalizacijo podatkov, s katero se določi najbolj stabilen gen za posamezno tkivo ali eksperiment.

Zakaj so potrebni referenčni (hišni) geni

Referenčni geni, včasih imenovani tudi gospodinjski (hišni) geni so potrebni za zagotavljanje osnovnih celičnih funkcij. Imajo krajše introne in eksone, več preprostih zaporednih ponovitev ter nižji potencial za tvorbo nukleosomov v 5′ regiji. So tisti, katerih izražanje ni odvisno od zunanjih dejavnikov ali eksperimentalnih pogojev. Običajno sodelujejo v osnovnih celičnih procesih – presnovi, sintezi beljakovin, translaciji ali celični strukturi. 

Da bi gen veljal za zanesljiv referenčni gen, mora izpolnjevati več pomembnih kriterijev:

– Njegova raven izražanja ne sme biti vplivana z eksperimentalnimi dejavniki.
– Mora kazati minimalno variabilnost izražanja med različnimi tkivi in fiziološkimi stanji organizma.
– Zaželeno je, da ima podoben cikel praga (Ct) kot gen, ki ga proučujemo.

Najpogosteje uporabljeni geni za relativno kvantifikacijo so ACTB (β-aktin: cito-skeletna beljakovina), GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza: encim glikolize), kjer sta slednja referenčna gena ena izmed najpogosteje uporabljenih referenčnih genov pri analizah izražanja genov, ostali pogosto prisotni referenčni geni pa so še  RPL13A, RPS18, TBP in PPIA.

Eden prvih uporabljenih referenčnih genov je ravno mRNA gena β-actin, ker je široko izražen v različnih tkivih. Vendar ima pomanjkljivosti — njegova raven transkripcije ni vedno konstantna, poleg tega pa prisotnost psevdo-genov lahko povzroči napačno detekcijo genomske DNA med qPCR, kar vodi do napačnih rezultatov kvantifikacije.

GAPDH je prav tako pogosto uporabljen referenčni gen, vendar se njegova izraženost razlikuje med posamezniki in skozi različne faze celičnega cikla. Prav tako je neprimeren v nekaterih sistemih, saj se njegova količina spreminja po zdravljenju z določenimi zdravili.

18S rRNA – Del ribosomske RNA, ključna za sestavljanje ribosomov in sintezo beljakovin. Zaradi visoke in stabilne ekspresije se pogosto uporablja kot referenčni gen.

28S rRNA – Prav tako ribosomska RNA, del večje podenote ribosoma. Zagotavlja stabilno osnovo za normalizacijo ekspresije mRNA.

ACTB (β-aktin) – Strukturni protein celičnega skeleta, vključen v obliko celice in transport celičnih komponent. Pogosto izbran kot referenčni gen zaradi konstantne ekspresije, vendar je lahko v določenih tkivih ali pogojih reguliran.

TUBA (α-tubulin) – Del mikrotubulov, pomemben za celično strukturo, delitev celic in transport organelov. Njegova ekspresija je relativno stabilna, a v delujočih ali stresnih celicah se lahko spremeni.

GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) – Encim glikolize, pogosto uporabljen kot referenčni gen, ker je osnovni metabolni protein. Vendar se njegova ekspresija lahko spremeni v stresnih ali eksperimentalnih pogojih.

HPRT (hipoksantin fosforribozil transferaza) – Encim pri presnovi purinov, stabilen v mnogih tkivih in pogojih, pogosto uporabljen za normalizacijo.

β2M (β2-mikroglobulin) – Del MHC I kompleksa, ki sodeluje pri imunski funkciji. Njegova ekspresija je običajno stabilna, a lahko variira v imunološko aktivnih tkivih.

TBP (TATA-box binding protein) – Transkripcijski faktor, potreben za iniciacijo transkripcije RNA polimeraze II. Njegova raven je razmeroma konstantna

CYCC (ciklofilin C) – Protein, ki sodeluje pri sklapanju proteinov in celični signalizaciji. Pogosto stabilen, a lahko občutljiv na določene stresne pogoje.

EF1A (elongacijski faktor 1α) – Encim, ki sodeluje pri podaljševanju verige med translacijo beljakovin. Stabilen v večini tkiv in eksperimentalnih nastavitev.

RPL32 (ribosomal protein L32) – Protein ribosoma, potreben za sestavo in funkcijo ribosomov. Njegova ekspresija je običajno konstantna.

Uporaba referenčnih genov in njihova vloga

Referenčni geni se v PCR-ju v realnem času (RT-qPCR) uporabljajo zato, da se rezultati normalizirajo in so primerljivi med vzorci. To pomeni, da rezultate izražanja ciljnih genov (target genes) popravimo glede na izražanje referenčnih genov, da odpravimo razlike, ki niso posledica dejanske biološke spremembe, ampak tehničnih variacij med vzorci  – to zagotavlja, da so vse spremembe v količini genetskega materiala primerljive med vzorcem in kontrolo.

Referenčni geni so notranji standard, ker imajo stabilno in približno enako ekspresijo v vseh vzorcih ter podobno raven transkripcije kot tarčni geni. Njihova ekspresija služi kot osnova za primerjavo. Tako dejanske spremembe tarčnega gena odražajo biološko regulacijo. Če teh razlik ne upoštevamo, se lahko zdi, da se izražanje gena spreminja, čeprav gre samo za eksperimentalno napako.

Zakaj več referenčnih genov?

Mnogi referenčni geni sodelujejo tudi v drugih procesih, ne le v osnovnem metabolizmu. To pomeni, da gen, ki je popoln v eni raziskavi, ni nujno primeren v drugi. Noben gen ni popolnoma konstanten, z uporabo le enega namreč lahko dobimo pristranske rezultate. Toda že študija Vandesompele et al. (2002) je pokazala, da se izražanje teh genov pomembno razlikuje med tkivi, razvojnimi stadiji in bolezenskimi stanji, da izražanje klasičnih referenčnih genov ni konstantno niti v enakem tkivu pri različnih posameznikih. Zato uporaba enega samega gena za normalizacijo povzroča sistematične napake v kvantifikaciji izražanja.  Napačno izbran referenčni gen pa lahko vodi do popačenih ali celo napačnih zaključkov o izražanju tarčnih genov, kar močno zmanjša znanstveno vrednost eksperimenta.

Zato smernice (npr. MIQE) priporočajo 2–3 validirane referenčne gene, da so izračuni zanesljivejši. Uporaba več referenčnih genov običajno poveča natančnost in ločljivost rezultatov.

Temeljna ideja je najti gen z nedvoumno stabilnim izražanjem, torej tak, ki je enak v vseh tkivih in posameznih vzorcih ter izpolnjuje že prej opisane kriterije za referenčne gene.

Normalizacija – validacija in izbor referenčnih genov 

Ker pa noben gen ni popolnoma stabilen, so razvili različne statistične pristope in algoritme za optimalno izbiro dveh ali več referenčnih genov. Med najpogosteje uporabljenimi so:

    • geNorm – razvrščanje genov po merilu stabilnosti M na osnovi parnih primerjav med geni.

Vandesompele in sodelavci so v prelomni študiji iz leta 2002 predstavili metodo geNorm, ki temelji na uporabi več referenčnih genov hkrati. Namesto da bi se raziskovalec zanašal na en sam “stabilen” gen, metoda izračuna geometrično sredino izražanja več stabilnih genov in tako dobi zanesljiv normalizacijski faktor. Stabilnost posameznih genov se izrazi z M-vrednostjo,  ki predstavlja povprečno parno variacijo njegovega izražanja glede na vse druge testirane gene in omogoča objektivno izbiro najprimernejših kandidatov. Ta pristop se je izkazal za veliko natančnejšega in je danes standardna praksa pri analizah qRT-PCR. Variacija med geni se izračuna kot standardni odklon log₂-transformiranih razmerij izražanja. Pred vnosom Ct-vrednosti iz qPCR so bile te pretvorjene v relativne kvantifikacijske podatke. Gen z najnižjo M-vrednostjo velja za najbolj stabilnega, gen z najvišjo pa za najmanj stabilnega.

Drugi učinkoviti pristopi za določanje referenčnih genov so tudi uporaba NormFinder, BestKeeper, ΔCt metoda – primerja izražanje parov genov znotraj istega vzorca.

Če v raziskavi ne upoštevamo pomembne vloge normalizacije, lahko pri merjenju ekspresije genov pride do razlik, ki niso posledica bioloških sprememb, ampak količine začetnega RNA materiala, učinkovitosti reverzne transkripcije v cDNA, razlik v pipetiranju ali koncentraciji vzorca ali  tehničnih napak – če bi samo merili Ct-vrednosti tarčnega gena, bi lahko napačno sklepali, da je gen “bolj” ali “manj” izražen, čeprav je razlika posledica teh tehničnih dejavnikov.

Primeri iz raziskav

V eni od raziskav so analizirali izražanje v 13 različnih organih in štirih fizioloških stanjih (normalno, nenormalno, bolezen, tumor). Za vsak organ so določili skupino genov, ki so stabilno izraženi znotraj in med različnimi fiziološkimi stanji. Ugotovili so, da ni univerzalnega referenčnega gena, temveč mora biti izbor specifičen za tkivo in pogoj. Večina stabilnih genov, ki so jih odkrili, je bila povezana z osnovnimi celičnimi procesi, kot so transkripcija, RNA procesiranje in translacija. Zanimivo je, da so mnogi izmed teh genov ribosomalni proteini (npr. RPL13A, RPL37A, RPS20) ali geni ubikvitinskega sistema (UBB, UBC), kar potrjuje njihovo funkcionalno povezanost s temeljnimi celičnimi procesi.

Pomemben prispevek k razumevanju stabilnosti referenčnih genov predstavlja tudi študija Pombo-Suarez (2008), ki je analizirala izražanje referenčnih genov v človeškem sklepnem hrustancu bolnikov z osteoartritisom. Preverili so deset pogosto uporabljenih genov z metodama geNorm in NormFinder in ugotovili, da so tradicionalni geni (GAPDH, ACTB, 18S rRNA) izrazno nestabilni, medtem ko so se TBP, RPL13A in B2M izkazali za najbolj stabilne. Avtorji so zaključili, da je za zanesljivo kvantifikacijo izražanja v hrustancu treba uporabiti kombinacijo teh stabilnih genov, kar potrjuje Vandesomplejevo načelo večgenske normalizacije.

Če sklenemo…

Rezultati predstavljene raziskave potrjujejo, da je izbira ustreznih referenčnih genov ključna za natančno in zanesljivo analizo izražanja genov z metodo qPCR. Čeprav je kvantitativni PCR ena izmed najobčutljivejših in najbolj prilagodljivih metod za kvantifikacijo nukleinskih kislin, je njegova zanesljivost močno odvisna od pravilne normalizacije podatkov. Referenčni geni omogočajo odpravo razlik v količini začetnega materiala, učinkovitosti amplifikacije ter variacij v izražanju med celicami. Idealni referenčni gen mora biti stabilno izražen ne glede na eksperimentalne pogoje, vendar v praksi tak univerzalni gen ne obstaja, zato je potrebno za vsako tkivo ali celično linijo posebej ovrednotiti stabilnost več kandidatov.

Kombinacija statističnih metod, kot sta geNorm in NormFinder, pa predstavlja zanesljivo orodje za objektivno oceno stabilnosti izražanja ter izbor ustreznih referenčnih genov pri kvantitativnih analizah qRT-PCR.

Na podlagi dobljenih rezultatov je mogoče zaključiti, da uporaba več referenčnih genov povečuje robustnost analize in zmanjšuje tveganje za napačno interpretacijo rezultatov, kar je skladno s priporočili MIQE smernic, ki poudarjajo pomen validacije referenčnih genov in transparentnega poročanja eksperimentalnih postopkov.

S tem je bila potrjena učinkovitost pristopa, ki vključuje oceno stabilnosti več kandidatnih genov, statistično analizo in izbor optimalnega števila kontrolnih genov za posamezno eksperimentalno okolje. Tak pristop omogoča zanesljivejše in ponovljive rezultate, kar je bistveno za pravilno interpretacijo sprememb v izražanju genov pri različnih bioloških in eksperimentalnih pogojih.

Postopek qPCR

Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) je sodobna metoda, ki se uporablja za natančno kvantifikacijo izražanja genov. Temelji na enakem principu kot klasična PCR – eksponentnem pomnoževanju določenega odseka DNA z uporabo termostabilne DNA-polimeraze (npr. Taq), začetnih oligonukleotidov (primerjev), deoksiribonukleozid-trifosfatov in ustreznega pufra.

Postopek poteka v treh cikličnih stopnjah:

1. Denaturacija, kjer se zaradi segrevanja prekinejo vodikove vezi med verigama DNA;
2. Prileganje začetnikov, ko se pri nižji temperaturi oligonukleotidi vežejo na komplementarne odseke tarčne DNA;
3. Podaljševanje (elongacija), kjer DNA-polimeraza sintetizira novo verigo DNA.

Z vsakim ciklom se količina produkta eksponentno poveča, dokler ne pride do izčrpanja reagentov in reakcija doseže plato.

V qPCR je posebnost ta, da potek reakcije spremljamo v realnem času z uporabo fluorescenčnih barvil in sond. Najpogosteje uporabljena sta SYBR® Green I in TaqMan, ki se nespecifično vežeta na dvoverižno DNA in po vzbujanju s svetlobo fluorescirata. Naraščanje fluorescence je neposredno sorazmerno s količino pomnožene DNA, kar omogoča sproten vpogled v potek pomnoževanja.

Vsak cikel, pri katerem fluorescenčni signal preseže ozadje, določa Cq (cycle of quantification) – vrednost, ki je obratno sorazmerna z začetno koncentracijo DNA v vzorcu. Na podlagi Cq in standardne krivulje je mogoče izračunati začetno koncentracijo cDNA, kar predstavlja osnovo za absolutno ali relativno kvantifikacijo izražanja genov.

Metoda omogoča detekcijo tudi zelo nizkih količin mRNA, vendar je za zanesljive in primerljive rezultate nujno uporabiti ustrezne normalizacijske metode. Ta pristop omogoča natančno in hitro kvantifikacijo količine nukleinske kisline v vzorcu ter velja za eno najbolj občutljivih in zanesljivih metod pri analizi izražanja genov.

Avtor: Eva Masten

LITERATURA

1. Adeola F. Normalization of Gene Expression by Quantitative RT-PCR in Human Cell Line: comparison of 12 Endogenous Reference Genes. Ethiop J Health Sci. 2018 Nov;28(6):741-748. doi: 10.4314/ejhs.v28i6.9. PMID: 30607091; PMCID: PMC6308757.
2. Kozera B, Rapacz M. Reference genes in real-time PCR. J Appl Genet. 2013 Nov;54(4):391-406. doi: 10.1007/s13353-013-0173-x. PMID: 24078518; PMCID: PMC3825189.
3. Pombo-Suarez M, Calaza M, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. Reference genes for normalization of gene expression studies in human osteoarthritic articular cartilage. BMC Mol Biol. 2008 Jan 29;9:17. doi: 10.1186/1471-2199-9-17. PMID: 18226276; PMCID: PMC2248200.
4. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002 Jun 18;3(7):RESEARCH0034. doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034. Epub 2002 Jun 18. PMID: 12184808; PMCID: PMC126239.
5. Housekeeping gene. Wikipedia, The Free Encyclopedia. Dostopano  [ 28. 10. 2025]. Dostopno na: https://en.wikipedia.org/wiki/Housekeeping_gene.
6. Ramovš T. Vrednotenje izražanja genov za katalitične podenote proteasomov v limfoblastoidnih celičnih linijah. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo; 2018. Dostopno na: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=101252
7. Ivanova Z, Petrova V, Grigorova N, Vachkova E. Identification of the Reference Genes for Relative qRT-PCR Assay in Two Experimental Models of Rabbit and Horse Subcutaneous ASCs. Int J Mol Sci. 2024 Feb 14;25(4):2292. doi: 10.3390/ijms25042292. PMID: 38396967; PMCID: PMC10889259.
8. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.
9. Pampel J. Housekeeping genes. Genomics-Online. Dostopano [29. 10. 2025]. Dostopno na: https://www.genomics-online.com/resources/16/5049/housekeeping-genes/

Viri slik

1. “Housekeeping Gene.” Wikipedia, The Free Encyclopedia. Wikipedia, The Free Encyclopedia, n.d. Web. 21 Oct. 2025. https://en.wikipedia.org/wiki/Housekeeping_gene.
2. Kozera B, Rapacz M. Reference genes in real-time PCR. J Appl Genet. 2013 Nov;54(4):391-406. doi: 10.1007/s13353-013-0173-x. PMID: 24078518; PMCID: PMC3825189.
3. Pampel J. Housekeeping genes. Genomics-Online. Dostopano [29. 10. 2025]. Dostopno na: https://www.genomics-online.com/resources/16/5049/housekeeping-genes/
4. Ramovš T. Vrednotenje izražanja genov za katalitične podenote proteasomov v limfoblastoidnih celičnih linijah. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo; 2018. Dostopno na: https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=101252
5. qPCR (real-time PCR) protocol explained . YouTube; Dostopano [17. 10. 2025]. Dostopno na: https://www.youtube.com/watch?v=iu4s3Hbc_bwhttps://www.youtube.com/watch?v=iu4s3Hbc_bw